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		从图书馆有针对性的筛选和抗体的优化单克隆抗

　　产生可溶性抗体片段、抗体基因克隆到phagemid必须表示没有噬菌体外壳蛋白。克隆个体抗体得到了孤立的基因轻、重链与限制酶或PCR扩增和religating成一个表达载体,不包含噬菌体蛋白基因。引入新的宿主细胞后,细胞的转化是孤立的单个菌落,每生产一个唯一定义的单克隆抗体。当自动化系统使用,384年殖民地采摘及成长,和抗体表达诱导。细胞随后细胞溶解,溶解产物是由一个人检测酶联免疫吸附试验(ELISA)特异性抗体物质的存在。

　　这个选择,言论和筛选过程是完成在4 - 6周,结果在识别多个独特的特异性单克隆抗体片段。这些抗体然后生长在更大的规模进行提纯。整个过程从开始到交货大约需要8周和代表一个大量的时间储蓄相对于传统抗体的生产方法。

　　单克隆抗体片段制造的这个过程是全功能的,包括完整的抗原结合位点与相同的内在抗原结合亲和力的抗体同行一样。他们有多种抗体格式(如。 ,单价外事局碎片,碎片)与二价外事局广泛选择的蛋白质标记,如6他的,为了简化净化和检测。由于模块化的系统,单克隆抗体片段也可以迅速转化成完整的免疫球蛋白分子,isotypes IgG1 IgG2,IgG4,IgA,IgM。

　　对于大多数应用程序,二价外事局碎片是首选的,因为他们提供增强的热望的存在导致两个抗原结合位点。然而,他们是明显小于一个免疫球蛋白分子和更容易扩散。此外,由于他们缺乏Fc地区机会更少,Fc受体的非特异性结合。一个完全体外过程开发重组单克隆抗体可以指导筛查的协议,可以区分密切相关的抗原和改善绑定特征的候选人抗体。几个不同的例子有针对性的筛选协议和一个示例的一个优化绑定活动如下所述。在执行一些特定的抗原定位和古典hybridomas是可能的,这个过程是更加杂乱,因为它出现在一个动物在哪些条件下不能轻易操纵。

　　修改后的氨基酸。识别抗原对修改后的氨基酸,图书馆是第一孵育未修改的形式的肽为了移除抗体识别它。这个过程称为耗尽图书馆。这时,其他相关肽通常添加,因为这样做会提高最终的特异性的抗体,是实现(参见图4)。图书馆是甄别与耗尽一个肽显示所需的修改(例如。 ,或氧化磷酸化氨基酸)产生抗体,将有一个更好的机会展示独特的特异性来期望形式的目标抗原而不是密切相关的分子。 4 确认成功,检测特异性抗体的质量控制(QC)ELISA对目标和两个相关和不相关的肽在净化和扩大规模。

　　图5。抗体识别单个氨基酸变异。 HuCAL上映的图书馆对全身的野生型蛋白和单一突变和转铁蛋白结合两BSA。抗体3绑定到所有三种形式,但抗体1和2是突变体特定的。

　　高度保守的抗原。阻塞/减法策略上面所描述的也适合选择特定的抗体当抗原是高度保守(例如。 ,一种蛋白质,略有不同物种之间或有一个单一的氨基酸突变)。图5比较了三种抗体的能力来检测野生型和单个氨基酸突变的靶抗原。此外,候选人筛选对不同载体分子,BSA和转铁蛋白。如果两个目标和相关蛋白质可用,图书馆可以耗尽之前的特异性抗原筛查与想要的目标。

　　区分零件从整个。有时候,希望能够发现只有一部分目标抗原和不完整的情况下分子在乳沟的产品,例如。如图6,HuCAL库,用于生成抗体两解理多肽的氨基酸每10,而没有认识到20氨基酸长篇肽。就像在例子上面所讨论的,这个不受欢迎的特异性与完整的肽用于耗尽图书馆前筛查与每个目标多肽。这个过程是理想的生产anti-idiotypic抗体用于临床监测。

　　图6。区分解理肽从完整的肽。图书馆的HuCAL第一次贫化与完整的肽(MNOP),然后是筛选与两半,MN和OP抗体1和2是特殊的对于肽锰、和4和5是特殊的对于肽抗体3承认两MNOP OP和OP。

　　提高重组单克隆抗体的亲和力。一个关键的优势生产抗体体外是,他们一旦创建,就可以进一步操纵和成熟。在最简单的情况下,这些操作需要改变一个重组单克隆抗体的结构性骨干或价没有修改特异性。因为HuCAL图书馆是模块化的,优化进一步绑定的亲和力抗体也是可能的候选人做额外的轮的筛选与混合和匹配方法来插入新的CDR序列在独特的侧翼限制性位点在CDR磁带(参见图7)。这种策略改进了抑制性抗体的亲和力与一只老鼠蛋白酶抑制剂逾300倍(见图8)。

　　Immunodiagnostic重组单克隆抗体的应用积极的控制和Calibrators。在病人血清抗体检测人类以各种格式或isotypes位于心脏的一个广泛的immunodiagnostic化验。例如,IgA免疫球蛋白g是关键指标,传染性疾病和自身免疫,免疫球蛋白e是重要的在测试过敏反应,IgM用于诊断早期免疫反应。大多数的这些测试需要积极的控制和calibrators。今天,虽然病人血清是目前被认为是金标准,这些多克隆同位素控制需要重复校准由于产品质量的变化,数量有限,病毒污染的风险。这个HuCAL技术创造了重组单克隆抗体在免疫球蛋白g,IgA,IgM格式在德国主要试管公司用于自身免疫测试。

　　配对的发展。这个体外筛选过程提供了一个有效的路径识别配对对elisa类型immunodiagnostic化验。这个过程可以识别检测抗体匹配现有的捕获抗体或反之亦然。它还可以选择一个新的配对对小说生物标志物。如果第二次绑定抗体是必需的,图书馆可以屏蔽使用第一抗体的抗原呈现为筛查,包括飘散的第一抗体,选择有针对性的向抗原而不是第一抗体。

　　当一个新的配对,是理想的,有两种策略。第一个策略是针对抗原标准平移,紧随其后的是测试的所有可能的组合选择的抗体作为捕获和检测抗体ELISA三明治。如果这个策略不成功,第二个策略是标准平移其次是筛选使用标记(如。 ,生物素化的)抗原,抗体检测他们是否适合作为捕获分子在ELISA。最好的捕获抗体被用于一个新的淘金来检测抗体的抗原结合当提出的捕获抗体。

　　技术生产重组单克隆抗体提供了众多的优势与传统的杂种细胞方法来开发immunodiagnostic单克隆抗体测定。 5 的主要优点是易于遗传操作,结果从一个完全定义的模块化系统,它允许简化下游变化和进一步优化,配合个别试验要求。此外,由于这一过程发生没有使用动物,有更大的灵活性在选择条件用于初始代单克隆抗体,包括使用毒素和定向筛选策略。最后,所有的重组单克隆抗体生产完全定义并获得一个安全、长期供应自质粒DNA序列很容易存储,迅速重建,充分表征。因此,利用DNA重组技术提高了效率和灵活性在识别单克隆抗体诊断试验开发。

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