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| 探讨了农杆菌介导籼稻遗传转化的主要影响因素 | |||
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| 研究系统地探讨了农杆菌介导籼稻遗传转化的主要影响因素。将广谱抗稻瘟病基因Pi9转入8个籼稻品种(丰源B湘晚籼11号，建立了稳定、高效的农杆菌介导籼稻的转化体系。通过农杆菌介导法。湘晚籼13号，R996527170125H00325H075和粳稻品种日本晴的愈伤组织中，得到转Pi9基因的株系，并对T1代和T2代转基因植株进行了GUSPCR和RT-PCR检测以及T2代植株的稻瘟病抗性鉴定。同时，对3个野生稻中的Pi29位点进行了进化分析。本研究主要结果如下： pc1301-Pi9质粒的鉴定 将大肠杆菌和农杆菌中提取的质粒pc1301-Pi9分别用限制性内切酶SalⅠ和KpnⅠ酶切，电泳分析标明质粒pc1301-Pi9可以在大肠杆菌和农杆菌中稳定遗传。 2高效转化体系的建立和Pi9基因对籼稻的转化研究不同培养基对籼稻愈伤组织诱导的影响 将8个籼稻品种的幼稚种子分别接种子NBN6MSCC和L3培养基上，结果标明，NBN6MSCC和L3这5种培养基诱导籼稻的平均出愈率分别为：81.7％、75.4％、68.0％、58.5％和55.5％。因此，NB培养基最适于诱导籼稻胚性愈伤组织 ABA 对愈伤组织诱导的影响 A BA 对某些品种愈伤组织的诱导具改善作用，可减少褐化死亡现愈伤组织的继代分析 比较了L3和NB两种培养基对愈伤组织继代效果，发现L3更适于愈伤组织继代。愈伤组织继代8d15d25d分析标明，愈伤组织宜选择继代15d左右做共培养较好，这时愈伤组织大而嫩黄且生命力强。共培养时间对转化的影响 以1701为受体，共培养时间为1d2d3d4d获得的抗性愈伤率分别为32.6％、68.2％、75.5％和60.0％。因此，共培养时间为3d转化效果最好，获得的抗性愈伤率最高，达75.5％。不同菌液浓度对愈伤组织转化的影响 用OD值为0.51.01.52.0菌液浓度与1701愈伤组织进行共培养，获得的抗性愈伤率分别为64.1％、74.7％、62.1％和51.0％。因此，OD值为1.0菌液浓度更适于籼稻愈伤组织的转化。乙酰丁香酮对转化的影响 共培养中加入200μmolL乙酰丁香酮可获得的较高的抗性愈伤率，为75.3％。菌液、共培养培养基以及同时在菌液和共培养培养基中加入乙酰丁香酮，获得1701抗性愈伤率分别为59.8％、68.3％和75.7％。标明菌液和共培养培养基同时加入乙酰丁香酮，转化效果较好。筛选压力的确定 40mgL潮霉素B浓度适用于籼稻抗性愈伤组织的筛选；20mgL潮霉素B浓度用于生根培养基中幼苗的筛选抗性愈伤组织的筛选情况 愈伤组织经S_40培养基筛选后，日本晴的抗性愈伤率达89.9％。籼稻的抗性愈伤率在69.4％～82.5％之间，其中R996为69.4％，25H003为82.5％。9个品种的转化情况 本研究日本晴的转化率是63.3％，籼稻品种阳性苗的转化率在3.2％～25.9％之间，其中25H075最低为3.2％，R996最高达25.9％。 10不同激素配比对愈伤组织分化率的影响 6-BA 2mgL+KT2mgL+NA A0.5mgL+IA A0.5mgL激素配比适于抗性愈伤组织的分化。GUSPCR和RT-PCR检测及稻瘟病抗性鉴定 对获得的T1代和T2代植株经GUSPCR和RT-PCR检测以及T2代植株的稻瘟病抗性鉴定，标明Pi9基因已整合到受体基因组中，并遗传给子代，子代中稳定表达。 4Pi29位点的进化分析 对3个野生稻中的Pi29位点NBS-LRR基因与Pi2和Pi9位点NBS-LRR基因进行序列比较分析，标明除假基因外的所有这些NBS-LRR基因属于相同的进化树，有共同的祖先，并且大多数NBS-LRR基因都有一个高度保守的内含子。这一研究为稻瘟病抗性基因的进化分析奠定了基础，并为植物中广谱抗性分子机理的说明提供了线索。 |
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